一、介紹

小鼠精原細(xì)胞（GC-1 spg）為貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈上皮細(xì)胞樣。

二、主要耗材、儀器及試劑

15ml離心管、50ml離心管、凍存管、巴氏滴管、培養(yǎng)瓶、封口膜、CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、顯微鏡、生物安全柜、DMEM、胎牛血清（FBS）、PBS緩沖液、青-鏈霉素（雙抗）、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）等等。

三、培養(yǎng)流程

1. 細(xì)胞復(fù)蘇

1)擦拭生物安全柜臺(tái)面，準(zhǔn)備好所需耗材，紫外30min，打開37℃恒溫水浴箱預(yù)熱所用試劑；

2)按照DMEM＋10% FBS＋1% P/S的比例配制血清培養(yǎng)基，吹打混勻后按10倍細(xì)胞的體積分裝至15ml離心管中；

3)從液氮中取出GC-1 spg細(xì)胞，在水浴箱中快速晃動(dòng)使其融化；

4)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至提前分裝有血清培養(yǎng)基的離心管中，吹打混勻；

5)1200rpm，離心3min；

6)棄去廢液，向離心管中重新加入新的培養(yǎng)基，重懸GC-1 spg細(xì)胞沉淀，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

2. 細(xì)胞傳代

1)細(xì)胞密度超過(guò)80%即可進(jìn)行傳代，拿出細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)液；

2)用PBS沖洗細(xì)胞2-3次（動(dòng)作要輕柔，清洗時(shí)可搖晃培養(yǎng)瓶以保證清洗效果）；

3)棄去廢液，向培養(yǎng)瓶中加入事先預(yù)熱好的胰蛋白酶（用量要足以覆蓋細(xì)胞層），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以利于消化；

4)1min左右后在顯微鏡下觀察細(xì)胞，當(dāng)90%細(xì)胞被消化下來(lái)時(shí)，向培養(yǎng)瓶中加入2-3ml的血清培養(yǎng)基，終止消化；

5)收集細(xì)胞懸液至15ml離心管中，1200rpm，離心3min；

6)等待離心過(guò)程中，可提前在新的培養(yǎng)瓶中加好完培（如T25培養(yǎng)瓶可先加4ml完培）；

7)棄去廢液，用2ml的完培重懸細(xì)胞后分裝至新的培養(yǎng)瓶中；

8)蓋上培養(yǎng)瓶蓋子，以劃“十字"的方式晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，以使細(xì)胞分布均勻，置于37℃，5%-10%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞凍存

1)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，棄去舊的培養(yǎng)液，用PBS清洗2-3次；

2)加入預(yù)熱的胰蛋白酶消化細(xì)胞，鏡下觀察消化后加入2-3ml完培終止消化；

3)收集細(xì)胞懸液至15ml離心管中，1200rpm，離心3min；

4)等待離心過(guò)程中，按照55% DMEM+40%FBS+5%DMSO的比例配制凍存液；

5)離心結(jié)束后，棄去上清，向離心管中加入凍存液，重懸細(xì)胞，分裝至凍存管中；

6)將凍存管放入程序降溫盒中（“慢凍"），置于-80℃冰箱中，第二天即可拿出細(xì)胞置于液氮罐中保存。

四、注意事項(xiàng)

1．培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基及血清等試劑最好沿用之前的，切忌頻繁更換；

2．棄去舊的培養(yǎng)液時(shí)最好不要直接倒掉，以免瓶口有殘留造成污染；

3．用胰酶消化細(xì)胞時(shí)，可輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，并在顯微鏡下觀察，細(xì)胞間隙變大，輕晃培養(yǎng)瓶細(xì)胞可自然流下時(shí)即可終止消化，切忌劇烈拍打培養(yǎng)瓶；

4．對(duì)于難消化的細(xì)胞可以分兩次進(jìn)行消化，以防胰酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞造成損傷；

5．一定要分清細(xì)胞培養(yǎng)瓶的正反面。

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