步驟

表達(dá)載體與 DNA 制備：

pSVTKGH，線(xiàn)性化 [ Selden et al.，1986]

此載體含有 SV 40 增強(qiáng)子及單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子序列，兩者可啟動(dòng)人類(lèi)生 K 激素（hGH ) 基因表達(dá)。hGH 可直接分泌到組織培養(yǎng)基上，可通過(guò)放射免疫學(xué)分析法直接檢測(cè) [ Ravid et al.，1991 ]。

pcDNA3，線(xiàn)性化（Invitrogen )

該表達(dá)載體在多克隆位點(diǎn)上游含有人類(lèi)巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子-啟動(dòng)子，下游含多聚腺苷酸信號(hào)及牛生長(zhǎng)激素（bGH ) 基因的轉(zhuǎn)錄終止序列。pcDNA3 載體還含有新霉素抗藥基因，用作篩選穩(wěn)定表達(dá)目的基因的抗性克隆。如本章方法中所述，pcDNA3 也可用作與報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染的篩選標(biāo)記。

1. 以 5X105個(gè)/ml 的濃度在 75 cm2 培養(yǎng)瓶中接種 L8057-Y10 細(xì)胞（F12/FB 培養(yǎng)基）（含谷氨酰胺（2 mmol/L )，青霉素（50 U/ml ) 及鏈霉素（5 μg/ml ) 的 Ham’s F12 , 添加 10% FBS (熱滅活；GIBCO #16140-014)），并于 37°C，5% CO2 孵箱培養(yǎng)細(xì)胞。

2. 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，收集細(xì)胞，4°C ，380 g 離心 5 min。

3. 用 10ml D-PBSA 洗滌細(xì)胞沉淀，4°C，380 g 離心 5 min。

4. 用 5 ml 電穿孔緩沖液洗滌細(xì)胞沉淀，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞。

5. 4°C，380 g 再次離心 5 min，收集細(xì)胞。

6. 用電穿孔緩沖液將細(xì)胞制成密度為 1X106 個(gè)/0.8 ml 的細(xì)胞懸液。

7. 將 0.8 ml 的細(xì)胞移至預(yù)冷的電穿孔杯中。

8. 分別加入 50 μg 和 5 μg 線(xiàn)性 pSVTKGH 及線(xiàn)性 pcDNA3 （如果實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菣z測(cè)特異基因啟動(dòng)子-報(bào)告基因表達(dá)，還需另設(shè)無(wú)質(zhì)粒 DNA 的電穿孔細(xì)胞，作為陰性對(duì)照）

9. 一只手緊握電穿孔杯，另一只手輕彈底部，以混勻 DNA-細(xì)胞懸液，將懸液于冰上孵育 10 min。

10. 在 400V /500 μF 條件下轟擊細(xì)胞懸液，并記錄時(shí)間。

11. 之后，取出電穿孔杯，在冰上擱置 10 min。

12. 將轟擊后的細(xì)胞移至盛有 10 ml F12/FB 的離心管中，另取少許培養(yǎng)基沖洗電穿孔杯，移回到離心管，離心，收集細(xì)胞。

13. 將細(xì)胞于 20 m l F12/FB 中再次懸浮，種到 75 cm2 培養(yǎng)瓶中，于37°C ，5 %CO2 培養(yǎng)箱中孵育，令新霉素抗性基因表達(dá)。

14. 24~48 h 后，離心收集細(xì)胞，然后用 20 ml 選擇性培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞。

15. 隨后，需每 2~4 天換液（選擇性培養(yǎng)基），以清除死亡細(xì)胞的碎片，并且使抗性細(xì)胞生長(zhǎng)，篩選過(guò)程至少需要兩周。

16. 測(cè)定 hGH 在細(xì)胞上清液的表達(dá)（見(jiàn) 27. 11.5 節(jié)）。