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    90%的人在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí),幾乎忽略了這6點(diǎn)注意事項(xiàng)!

    發(fā)布時(shí)間: 2021-11-25  點(diǎn)擊次數(shù): 2224次

    轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的一種專門技術(shù)。分為

    物理介導(dǎo)方法電穿孔法、顯微注射和基因槍;

    化學(xué)介導(dǎo)方法:如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的技術(shù);

    生物介導(dǎo)方法:有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)。理想細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法,應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),是目前最高轉(zhuǎn)染效率的方法,同時(shí)具有細(xì)胞毒性很低的優(yōu)勢(shì)。


    但是病毒轉(zhuǎn)染方法的準(zhǔn)備程序復(fù)雜,常常對(duì)細(xì)胞類型有很強(qiáng)的選擇性,在一般實(shí)驗(yàn)室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法,則各有其特點(diǎn)。需要指出的一點(diǎn),無論采用哪種轉(zhuǎn)染技術(shù),要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果,可能都需要對(duì)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化。影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多,從細(xì)胞類型、細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞生長狀態(tài)到轉(zhuǎn)染方法的操作細(xì)節(jié)。下面列舉一些影響因素。


    90%的人在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí),幾乎忽略了這6點(diǎn)注意事項(xiàng)!



    1、血清





    A、DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物形成時(shí)不能含血清,因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成。


    B、一般細(xì)胞對(duì)無血清培養(yǎng)可以耐受幾個(gè)小時(shí)沒問題,轉(zhuǎn)染用的培養(yǎng)液可以含血清也可以不加,但血清一度曾被認(rèn)為會(huì)降低轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入血清需要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。


    C、對(duì)于對(duì)血清缺乏比較敏感的細(xì)胞,可以使用營養(yǎng)豐富的無血清培養(yǎng)基,或者在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中使用血清。對(duì)血清缺乏比較敏感的貼壁細(xì)胞,建議使用專用轉(zhuǎn)染試劑。有條件的話,可以用無血清培養(yǎng)基代替PBS洗細(xì)胞兩遍,注意洗的時(shí)候要輕,靠邊緣緩緩加入液體,然后不要吹吸細(xì)胞,而是轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)板讓液體滾動(dòng)在細(xì)胞表面。如果洗的太厲害,細(xì)胞又損失一部分,加了脂質(zhì)體后,細(xì)胞受影響就更大了,死亡細(xì)胞會(huì)增多。



    2、抗生素(PS)





    抗生素,比如青霉素和鏈霉素,是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些抗生素一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒,但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性,使抗生素可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性,導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以,在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用抗生素,甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用抗生素。這樣,在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素,ICIN選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。另外,為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長,使用比含血清培養(yǎng)基更少的抗生素量。



    3、細(xì)胞狀態(tài)





    這點(diǎn)非常重要,不要急于求成,一定要讓細(xì)胞處于最佳的生長狀態(tài)再做。有文獻(xiàn)說傳代不要超過17代。細(xì)胞復(fù)蘇后的3代左右時(shí)細(xì)胞狀態(tài)最好,不要用傳了很多代的細(xì)胞去做,細(xì)胞的形態(tài)都會(huì)發(fā)生變化。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體,原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變,總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化,融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。因此,如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低,可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果?;蛘?,幾種來源于經(jīng)篩選,轉(zhuǎn)染效率較高細(xì)胞亞系的細(xì)胞系現(xiàn)在有售。



    4、細(xì)胞鋪板密度





    用于轉(zhuǎn)染的最佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用,細(xì)胞太少,容易死。一般轉(zhuǎn)染時(shí),貼壁細(xì)胞密度為70%-90%,懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml,確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感,所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做。



    5.啟動(dòng)子的選擇





    獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動(dòng)子,如SV40和RSV(勞斯肉瘤病毒)相比,在BHK-21中其活性最高。這三種病毒啟動(dòng)子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系,如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子,而單PMA就足以激活KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時(shí)會(huì)提高,因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。



    6、DNA量





    高質(zhì)量的DNA對(duì)于進(jìn)行高效的轉(zhuǎn)染至關(guān)重要。轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒一定純度好、濃度高、無內(nèi)毒素。濃度不要低于0.35ug/ul。產(chǎn)物表達(dá),48小時(shí)mRNA表達(dá)最高;72h蛋白表達(dá)最高。


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