1. 將含有凍存細(xì)胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解凍。

2. 用 70% 乙醇對(duì)安瓿的頂端進(jìn)行消毒，打開(kāi)安瓿，用吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有 5 ml 起始培養(yǎng)基的 25 cm2 組織培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，將其放入 5% CO2 加濕培養(yǎng)箱中 37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。

3. 吸出起始培養(yǎng)基，換成適當(dāng)?shù)木S持培養(yǎng)基。將細(xì)胞放回 CO2 培養(yǎng)箱 37℃ 培養(yǎng)，每天檢查細(xì)胞是否生長(zhǎng)至匯片。

4. 如果細(xì)胞生長(zhǎng)至匯片，吸出培養(yǎng)基。

5. 用 PBS 或胰酶/EDTA 清洗細(xì)胞，除去細(xì)胞上殘留的血清，將洗液吸出。

6. 用 37℃ 、適當(dāng)體積的胰酶/EDTA 剛好覆蓋單層細(xì)胞（如對(duì)于 25 cm2 培養(yǎng)瓶需要 0.3 ml）。消化 30～40 s（細(xì)胞應(yīng)該分開(kāi)），晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞*分開(kāi)。

7. 加入 1.4 ml 適當(dāng)?shù)木S持培養(yǎng)基，用吸管來(lái)回吹打細(xì)胞懸液多次以打散細(xì)胞團(tuán)（這些細(xì)胞用于傳代）。

8. 吸出 0.5 mL 的細(xì)胞懸液，將其加入到新的含有 30 ml 維持培養(yǎng)基 150 cm2 的組織培養(yǎng)瓶中。輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中，將其放入 CO2 培養(yǎng)箱中 37℃ 培養(yǎng)直到細(xì)胞生長(zhǎng)至匯片（大約 1 周）。大約間隔一周用維持培養(yǎng)基進(jìn)行 1:20 稀釋傳代以維持細(xì)胞生長(zhǎng)。